问题解答

最常见问题

Q:用于PinpoRNA正常探针设计的待测序列最短需要多少碱基?

A:PinpoRNA探针通常用于检测长于300碱基的mRNA/ncRNA。为了保证一个拷贝的灵敏度,通常会需要1000碱基左右并设计15组以上的探针。短的目标序列(<300nt)也可以设计,但可能会影响灵敏度。针对miRNA的探针可以检测17-50碱基,但灵敏度会受影响,详询技术支持。

Q:做这个实验我需要准备些什么?

A:做PinpoRNA原位检测,需要PinpoRNA专用探针和至少一种试剂盒。探针包括目标探针,阴性探针,以及本物种的阳性探针(高表达内参基因)。试剂盒则因应需要有多种可供选择。 还需要PinpoRNA专用的核酸原位杂交仪(SH-08)。可以煮沸烧杯里液体的加热器,以及专用的疏水笔。以及一些常用的组化试剂和配件(脱蜡试剂,核染试剂,封片剂,超纯水,洗缸,烧杯,玻片架等等)。

Q:PinpoRNA原位杂交和普通的免疫组化在流程上有什么关键的不同之处?

A:主要有以下不同之处: ①在预反应液Bplus高温修复后无需冷却。请直接将片子浸入常温纯水中洗涤。 ②过程中有消化酶步骤进行消化,请注意,共染时该步骤有可能对目标蛋白造成伤害。 ③必须使用核酸原位杂交仪(SH-08),用以保持杂交所需温度的同时保持杂交环境的湿度以阻止杂交液挥发。 ④应按手册要求使用合适的封片剂。 ⑤化学显色的核染试剂使用Gill’s Hematoxylin I。或将其稀释一倍使用。 ⑥必须使用指定的疏水笔(Vectorlabs,货号:H-4000)。

Q:样本要如何固定?使用4%多聚甲醛(PFA)还是10%中性福尔马林(NBF)?

A:医疗系统常规的病理切片制作方法均可满足实验要求。对于FFPE样本而言,大部分样本应及时用新鲜的10%NBF(neutral buffered formalin)在常温固定16-32小时。不建议在4℃固定。小于16小时会固定不足,超过32小时导致的过固定会让信号难以检测。石蜡切片建议厚度为5±1μm, 经固定冰冻切片7-15μm,新鲜冰冻切片10-20μm。

Q:需要做对照吗?

A:PinpoRNA强烈建议每次实验做某例样本的至少三张连续切片:分别是做目标基因,阴性对照探针,阳性对照探针。阳性对照探针通常是本物种的高表达内参基因,用于检验样本的RNA降解程度是否合适用于实验。阴性探针通常使用细菌的DAPB探针(也可指定别的)用于判断样本本身有无产生干扰信号导致假阳性。

Q:实验有哪些关键步骤要注意?

A: ①不论样本面积多小,疏水圈圈内面积大小必须至少15x15mm。探针杂交液使用体积(滴数)严格按照手册。以免因为长时间杂交导致水分挥发/杂交液盐浓度升高,最终杂交失败。 ②消化酶步骤开始后,任何情况下不要让样本干燥,包括肉眼不易察觉的干燥。比如多片实验时,应滴加杂交液后摆放好再处理下一张片子,而不是将所有甩干的片子在杂交仪上摆放整齐后才逐一滴加。以及杂交仪上的所有8个水槽均应加水以保持环境湿润。 ③即用型探针、反应液1、反应液2、反应液3(或反应3稀释液)使用前需预热溶解所有沉淀并混匀。 ④50×洗液和25×预反应Bplus在运输和储存时会有沉淀,使用前先预热溶解沉淀。 ⑤不要改变步骤顺序。按照实验手册确保每一步使用正确的试剂。使用指定的疏水笔和防脱玻片。

Q:如何组合探针进行多通道检测?

A:将浓缩探针,按比例稀释入即用型探针杂交液中即可得到混合探针使用。也可以将浓缩探针加入探针杂交液(单独购买)中,即可用于杂交。 多通道检测时,通常需要混合不同型别的探针(I/II/III型)才能在一张片子上分别显色。 试剂盒附赠的阴阳对照探针通常是已经混合好不同型别的探针,可直接使用。

Q:多通道实验中如何跳过某个通道?可以完全不加任何探针吗?

A:忽略用于该通道的反应3步骤以及底物标记步骤即可。2小时的探针杂交反应可以只使用探针杂交液不加任何浓缩探针。请注意各试剂盒需配合使用的探针型别。

Q:整个实验在哪一步可以暂停?

A:有好几个暂停点,但建议尽量一次性做完。 ①切片后石蜡切片可以烤片15分钟后冻存于-20℃大约3-12个月或室温密封干燥保存1-3个月。冰冻切片应密封保存于-20℃(最好-80℃)不超3个月。 ②画完疏水圈后,可室温或冷藏干燥过夜,第二天使用。 ③探针杂交做完后,将片子室温浸泡在5xSSC中过夜,第二天用1x洗液室温洗两次后接着使用。

Q:需要什么配置的显微镜?

A:荧光试剂盒需配合荧光显微镜或共聚焦显微镜,并使用正确的滤光片。化学显色试剂盒只需明场显微镜。

Q:PinpoRNA的信号通常是什么样?看到的“点”代表什么?

A:典型的RNA原位杂交信号呈边缘清晰的圆点状,每一个圆点都代表此处有至少一个拷贝的RNA分子。

Q:点的大小深浅代表什么?

A:点的颜色深浅和大小和多因素有关。比如设计的目标探针组有多少组结合于目标序列,底物显色时间,酶的活性。但比起大小和深浅,点的数目是拷贝数的最直接反映,因为一个点就至少一个拷贝。

Q:影响信号的关键因素是什么?

A:控制杂交的温度和湿度是实验成败关键。请务必使用我们推荐的杂交仪以保持最佳的实验结果。消化酶消化也是影响实验结果另一主要因素。消化不足导致信号减低或背景。消化过度会破坏组织的形态或RNA丢失,因此要优化此步骤时间与浓度。

关于PinpoRNA新一代原位杂交试剂

Q:新一代原位与传统的原位杂交有什么区别?为什么要用新一代试剂?

A:传统的原位杂交通常使用一段较长的探针(至少几百碱基),直接杂交于待测核酸,通过该探针上的地高辛或荧光标记观察信号,因此通常无法和同家族基因相区分,对位点的变异也不敏感,因为标记物数目太少所以检测灵敏度较低。尤其当待测的是mRNA时,由于mRNA大多处于一定的降解(片段化)状态,传统长探针无法杂交结合,因而检测不到或特异性很差,这也是几十年来一直没有RNA原位杂交商业化试剂盒的原因。 新一代的原位杂交,大都采用了短探针(20-50碱基),可以很好地结合即使有一定片段化的RNA序列,且产生的信号都经过线性放大系统进行放大,可以很好的解决传统原位杂交的特异性和灵敏性问题,真正做到商业化的通用检测。

Q:PinpoRNA杂交检测试剂和进口同类产品有什么区别?

A:我们的探针系统已经申请了中国专利,相比于进口试剂,它可以很好地解决多探针结合时,产生的效率低下的问题,提高检测灵敏度。另外在放大系统上开发了一套专利的高效线性放大系统,这套放大系统,同样提高了放大效率,因此比进口试剂操作简单,步骤更少,但可以实现更高的信噪比结果。此外,由于这套杂交信号放大系统,并不依赖于任何蛋白质的生物学活性,只依赖于核酸序列的物理化学性质,因此PinpoRNA在检测过程中受到的环境干扰要比其他基于蛋白/酶学功能的等温扩增试剂小得多,在操作上更方便结果更可靠。

Q:试剂可以用于检测哪些RNA/DNA?

A:理论上长度大于100碱基的核酸序列都可以检测,但由于检测灵敏度和探针覆盖的核酸序列长度成正比,通常至少500-1000碱基长目标序列才能保证最佳的检测灵敏度。

Q:新一代原位杂交盒为什么比传统试剂昂贵?

A:我们采用的是几十条HPLC纯化的高纯度短探针,并配以放大系统,因此在成本上要比传统的单一标记长探针高很多,但换来的是高质量的特异性和灵敏度(信噪比)。

Q:是否提供检测服务?

A:可以提供。请联系代理商咨询。

Q:试剂盒有现货吗?货期保质期多久?

试剂盒长期现货,且赠送底物,荧光试剂盒(不含荧光底物)保质期为1年,化学试剂盒保质期为9个月。定制合成的探针货期2-3周。

Q:PinpoRNA 1.0和2.0有什么区别?

A:2.0版改进了样本前处理,方便实验条件优化,能保持更佳的组织形态。在信号强度上,显著优于同类试剂,信噪比更高。

Q:试剂盒可以检测细菌/真菌/病毒吗?

A:可以。详见探针设计部分或联系技术支持。

Q:我可以只买探针不买试剂盒自己做杂交吗?或者只买试剂盒自己设计探针吗?

A:都不可以。我们的探针和试剂盒是配套使用的,客户无法自行完成。

关于探针的设计

Q:探针可以自己设计吗?为什么有不同型别?

A:由于探针的复杂性,我们会为客户设计探针。可以用不同的荧光分子标记不同型别的探针,如此在同一张片子上实现多色检测。

Q:为什么购买探针前要和技术支持沟通,类似进口试剂一样直接根据探针货号下单不可以吗?

A:客户经常会对探针的设计提出个性化需求,因此只根据货号下单并不能确保该探针满足您的需要。购买前与技术员详细沟通可以确保得到自己所需要的探针。比如有时候需要该探针检测所有剪接体,有时候只检测某些剪接体,有时候需要跨物种通用检测,有时候要保证物种特异性,这些都必须详细沟通。和进口探针不同,通常情况下品博易视的探针会保证其在家族基因中的检测特异性,而不会只根据该基因本身的标准序列进行机械式设计,这在某些有很多家族成员的基因时非常重要否则检测结果将来自多个家族基因!

Q:购买探针或进行设计时需要提供什么信息?

A:请至少给出物种,基因名称,Gene ID。 可以指定某reference sequence,并告知检测目的,比如是否针对某剪接体,针对某段敲除序列,是否跨物种,以及是否做过qPCR验证及qPCR扩增区以便我们将探针覆盖此区进行验证实验。当有多个基因时,可以给出希望如何组合检测这些基因。我们会及时反馈设计可行性及方案,此服务免费。

Q:公司可以告知客户具体的探针序列吗?

A:基于商业考虑,我们无法给出每一条探针的序列,但我们会给出所有探针覆盖了待测基因的哪些具体的区域。连同货号信息,可以放在文章中发表,对于新一代原位杂交方法,杂志编辑部均可接受。信息可在网页查询或联系技术支持。

Q:探针设计需要多久,多久可以到货?保质期怎么样?

A:设计沟通通常24小时内即可完成(全年无休)。非现货探针约2-3周到货。现货探针随时发货。探针如按要求使用储存,我们保证有效期从收货之日起至少12个月,最长可以保存24个月。

Q:探针是否可以用于其他公司的试剂盒,或者反之?

A:不可以。我们公司探针/试剂盒都只能自行配合使用。

Q:探针是否额外收取设计费用?

A:目前针对人/大鼠/小鼠/斑马鱼的任何探针不收取设计费用,不论是否定制设计合成,所有探针均一目录价。

Q:你们的探针是用什么基团标记的?

A:都是短的DNA探针,并没有任何标记。

Q:如何保证探针的特异性?特异性的基本原则是什么?

A:PinpoRNA每一条探针均有三个结构域,一部分结合于目标基因,一部分和组内探针结合,一部分结合于放大系统。通过每组探针2-4条同时杂交于指定区域实现检测,而这几条探针同时结合于非特异位点的可能性小于百万分之一。通常情况下,每一个目标基因我们会设计15-20组探针用于检测以达到单拷贝的灵敏度。此外,不同于其他公司的探针,我们的探针设计时充分考虑了家族基因/同源基因的干扰,因为有些家族基因有很高的同源序列。通常情况下,如果没有特别指定,我们会尽量同时检测所有剪接体。

Q:如何保证探针/试剂盒的检测灵敏度?

A:PinpoRNA有专利的放大系统,在覆盖正常长度的待测序列和样本为培养细胞时,通常可以达到单拷贝的灵敏度。如果有需要特别增加灵敏度,可以通过增加探针以覆盖更长的目标序列来实现,但会涉及额外费用。

Q:不同基因的探针是否可以混合使用?

A:可以混合使用,这样测出来的信号来源于所有基因。

Q:检测微生物(细菌/真菌/病毒)的探针都可以设计吗?有什么要求?

A:微生物的特异检测通常取决于有没有特异的序列可以用于区分该物种。 对于病毒,由于不同病毒之间的序列通常差别很大,因此设计探针检测某类病毒是可以做到的。如果要区别病毒亚种,则要详细分析亚种间序列的差异,通常也都可做到。 对于细菌和真菌,情况比较复杂,由于种属间rRNA序列的高保守性,针对rRNA设计的探针通常只可用于某一类型的细菌/真菌检测,无法做到种间甚至属间的区分。如果要针对某一“种”进行特异检测,则必须提供经验证的该”种”的特异序列来设计探针,此序列必须由客户负责提供,我们公司仅负责设计的探针可以完美检测该序列,而无法保证其他‘‘种’‘是否因为也有该序列或高度同源序列而被检测到。

Q:植物/特殊物种的RNA检测探针可以设计吗?

A:可以,和哺乳动物的探针设计没有本质区别。

Q:LncRNA可以检测吗?

A:100碱基以上的通常可以。

Q:MirRNA可以检测吗?

A:可以。但mirRNA由于序列较短,通常不容易保证探针对其家族成员的特异性。因此如有特异性的疑问,客户应自行准备家族不同成员的合适阳性样本,验证所合成探针的检测特异性。PinpoRNA目前无法一一验证承诺。

Q:点突变可以检测吗?

A:目前不提供。

Q:环状RNA可以检测吗?

A:目前不提供。

Q:不同剪接体可以区分吗?

A:有些可以,需要具体情况具体分析,请于下单前沟通好。

Q:PinpoRNA的探针是如何QC的?每一个目标探针均经过原位杂交验证吗?

A:PinpoRNA的探针均按特定的寡核苷酸参数标准设计,和通常的PCR寡核苷酸相比,除了引物序列和退火温度可以保证以外,还进一步规范了在PinpoRNA杂交条件下的最佳序列和纯度,保证最低可能的非特异杂交产生。新合成的探针并不会一一验证,主要是因为这些都是化学合成的普通无修饰寡核苷酸引物,根据其合成的退火温度已经可以精确计算出探针的杂交温度。但所有现货探针均已经过客户/公司原位杂交验证。

Q:PinpoRNA的探针可否用于跨物种检测?

A:主要取决于跨物种序列的相似度。如果大于95%则通常可以。请联系技术支持。

关于样本制备与处理

Q:什么样本可以用于做RNA原位杂交?什么样本不可以?

A:如果一个样本可以完美“固定“于某基质(如玻片)上,即可以做RNA原位杂交,反之则不行。比如石蜡切片冰冻切片组织芯片都可以做,但液体样本中的RNA就无法检测。但诸如血液样本等,则可以做成细胞涂片方式解决。整胚样本也是可以的。

Q:石蜡切片冰冻切片制作有什么特殊要求?

A:按常规的制片方法即可,没有特殊要求。但应尽可能地防止RNA的降解,及时将样本用甲醛或多聚甲醛固定。

Q:样本处理过程如何影响实验结果?

A:主要是RNA降解程度会影响实验。在取样后快速清洗/灌流,然后应及时固定一定时间(12-36小时)。但甲醛或多聚甲醛固定太久(>3天)也会造成RNA不易检测。

Q:保存多久的样本还可以用于实验?

A:经过固定的石蜡样本块在低温(4度或冻存)可保存较长时间。无固定的冰冻样本则一般只可以保存几个月。

Q:石蜡样本/切片应如何保存?

A:石蜡块应尽可能在4度或冻存。 切片后应完全晾干后60℃烤片30-60分钟,冻存于-20℃。但随着保存时间的增加,RNA也会缓慢降解,保存时间和转录水平高低有关。

Q:冰冻样本/切片应如何保存?

A:应-80℃冻存。尤其未经固定新鲜样本,应避免冻融,新鲜未固定切片一旦冻融一次,RNA即严重降解。

Q:细胞样本应如何保存?

A:甲醛或多聚甲醛固定后梯度酒精脱水,保存于-20℃。详见实验手册。

Q:用于检测服务的样本应如何运输?用于检测服务的样本有什么要求?

A:经过甲醛或多聚甲醛固定的样本可以用冰袋和泡沫箱运输。未经固定的必须全程干冰运输(切片不建议运输)。

Q:整胚样本(比如斑马鱼/小鼠胚胎)可以做吗?要怎么处理?

A:可以做。处理方式多样,根据处理方法不同,后续应采取不同方法暴露待测RNA。

Q:骨组织可以做吗?

A:可以,必须用建议的快熟脱钙液脱钙,防止脱钙过程RNA的降解。

Q:样本为什么会脱片?

A:固定不足,包埋渗透不好,未干透即烤片,未使用防脱玻片等都会造成脱片。

关于实验操作

Q:玻片杂交仪是必须的吗?可以用水浴锅/恒温箱代替吗?

A:做石蜡和冰冻切片必须使用我们推荐的玻片杂交仪(比如品博易视的SH-08)。不可以使用水浴锅或者恒温箱。

Q:煮沸修复步骤可以象免疫组化一样用水浴锅或微波炉吗?

A:不可以使用微波炉或电磁炉。可以使用水浴方法,但请严格按照水浴修复的步骤进行。参见手册。使用水浴时温度很难达到99-100℃,如果使用水浴锅,必须用温度计伸入1×B plus修复液中直接测量温度,确认达到99℃以上方可使用。使用水浴锅时,由于长时间加热方能达到99℃,要防止1×B plus修复液因蒸发被过度浓缩。

Q:疏水笔可以用别的牌子吗?

A:别的牌子的免疫组化使用的疏水笔在本实验中通常都会出现疏水圈脱落的情况。因此请一定使用指定品牌(Vectorlabs,货号:H-4000)。

Q:玻片类型可以随便选用吗?

A:必须用高质量的防脱玻片,有些防脱玻片虽然防脱但会造成背景信号。

Q:用进口密封型杂交仪有什么注意事项?

A:用进口密封型杂交仪时使用的杂交液可以减少1/3使用量。机器应全程保持40℃度不关机或中断。由于看不见玻片上的液体状态,放入机器时应小心平稳,避免液体流出疏水圈。可能的话,拍下照片,比较杂交前后疏水圈内杂交液体是否明显减少。

Q:用开放式杂交仪有什么注意事项?

A:机器应全程保持40℃度不关机或中断。盖子上应放上湿纸条。疏水圈内应滴加足量杂交液(见手册)。空余玻片位置须摆放空白玻片并画圈后滴上足量水,目的是要尽量保证杂交时空间内的湿度。

Q:实验用的试剂必须经DEPC处理或者保证无Rnase的吗?(比如RNase free PBS?)

A:建议样本在固定前的清洗处理和切块时应遵循无RNase环境的原则,一旦正确固定后,RNA通常不会受实验手册所述步骤导致降解。因此MilliQ水(超纯水,18.2MΩ)即可,可以不需要DEPC水。

Q:杂交温度要很准确40度吗?

A:是的,杂交温度对实验的特异性很重要,可以40±1℃。

Q:试剂有看到沉淀怎么办?

A:即用型探针,反应1,反应2,反应3稀释液,冷藏都有沉淀,使用前必须在37-40℃预热5分钟,上下颠倒混匀后方可使用。50×洗液如果低温运输也会出现沉淀,必须预热溶解沉淀后方可使用。其他试剂不会出现沉淀,回复室温即可使用。

Q:可以为了节约试剂减少使用体积吗?

A:绝对不可以。在40℃杂交时,减少体积会导致液体挥发盐浓度升高,导致杂交一定失败!常温反应在湿盒中进行时,可酌情减少体积完全覆盖组织即可, 但初次实验请跟随手册指引。

Q:阴阳对照是否一定要做?

A:强烈建议每次实验都要做技术型阴阳对照,尤其第一次实验必不可少。阴性对照通常使用赠送的细菌DapB探针(也可购买不含探针的杂交液),有助于判断信号是否是背景造成的假阳性信号,遇到低表达基因时尤其重要。阳性对照(赠送的同物种看家基因)用于判断样本质量及操作是否有误,通常看家基因在大部分器官组织都有较高表达,如果信号偏低或者没有,则怀疑样本质量问题或操作有误。

Q:脱蜡可以用环保脱蜡剂吗?

A:可以。保证脱蜡完全即可。

Q:预处理A有什么功能?孵育时间可以调整吗?

A:预A可以抑止内源性过氧化物酶,碱性磷酸酶等干扰酶源,尤其针对一些超量异常表达的癌症样本,可以延长处理时间至30分钟。如果背景信号仍然严重,请与技术支持联系灭活方案。

Q:Bplus煮沸步骤有什么功能?时间是否可调?

A:此为修复步骤,可以协助暴露待测RNA和蛋白。时间可调整,通常时间越久,信号有所增强,但组织形态变差。应注意1×Bplus不可沸腾太久导致盐浓度升高。

Q:酶消化时间浓度有什么讲究?可否更换消化酶?

A:时间越久浓度越高消化越剧烈,一定范围内信号也越高,但形态会变差。客户可以更换自己熟悉的消化酶,但极大可能需要优化浓度和时间达到最佳效果。

Q:探针孵育时间可调吗?

A:不需要调整。

Q:化学显色放大反应1/2/3/4/5孵育时间可调吗?

A:反应1/2/3的孵育时间可延长5-10分钟,并无影响。尤其使用密封型的杂交仪时,考虑到孵育盒的升温需要,应适当延长5分钟。反应4/5的时间会影响显色强度。

Q:荧光标记放大反应1/2/3/底物孵育时间可调吗?

A:反应1/2/3的孵育时间可延长5-10分钟,并无影响。尤其使用密封型的杂交仪时,考虑到孵育盒的升温需要,应适当延长5分钟。底物孵育时间和荧光强度正相关,但无需超过30分钟。

Q:试剂反复40度预热,多次使用后有无影响?是否可以分装?

A:每次预热5-10分钟,不会有影响。不建议分装,如要分装,应把沉淀完全溶解。

Q:可否先画好疏水圈再做预反应A?

A:可以。如果这样,则煮沸后水洗完,即可进行酶消化步骤,无需酒精处理晾干。

Q:化学显色/荧光反应中的细胞核染色可否不按说明书建议的,用我自己的方法染色?

A:可以。

Q:封片剂有什么要求吗?

A:化学红色显色试剂盒使用的底物可使用任何极性封片剂。(水溶脂溶都可)。

Q:可以更换显色底物吗?

A:化学显色试剂盒可根据需要换AP酶对应的底物。

Q:拍照有什么要注意的?

A:不论使用何种设备拍照,不同片子的相同通道(颜色),尤其阴阳对照,都必须使用完全相同的参数设置。

Q:数据/图像如何分析?

A:可通过点数,面积,深浅做初步比较,亦可用专业图像分析软件。

Q:做组织芯片有什么要注意的?

A:组织芯片通常由不同年代不同制备条件的样本组成,因此样本质量非常参差,横向的结果比较应考虑这个因素。因此必须1)先测试单片组织有代表性的样本以确认实验条件和实验大致结果2)必须做阳性看家基因之类的以了解片子质量差异,避免误判目标基因的弱/阴性检测结果。

Q:特殊样本(比如整胚)的实验操作有什么建议?

A:整胚的前处理条件应进行多种优化,才能找到最佳条件。请和技术支持详细沟通。

关于化学显色试剂的显色

Q:化学红色试剂盒使用的是什么酶?什么底物?

A:使用的是碱性磷酸酶和快红底物。

Q:我可否更换自己的底物?

A:可以换其他AP底物。

Q:颜色强弱怎么调整?

A:缩短或者延长反应4的时间可以减弱或增强信号。但阴性对照也应相同时间。

Q:为什么阴性对照做出来也会有几个红点?

A:很多偶然因素会造成在一个视野中有几个随机红点,我们的阴性标准是少于1点/10细胞。

Q:做好的玻片可以放多久?

A:质量好的封片剂可以一两年。

Q:封片剂可以用中性树胶吗?

A:可以。但树胶通常微黄色或有沉淀干扰。

Q:数据怎么分析?

A:可参考免疫组化的分析方法,半定量分析或用软件分析。

Q:是否提供双色化学显色的试剂盒?

A:请与技术支持联系。

Q:试剂是否要避光保存?

A:不要阳光直射即可。

关于多色TSA荧光标记

Q:多色荧光试剂盒的显色原理是什么?用什么底物?

A:不同通道的探针依次被标记上过氧化物酶,进行TSA荧光反应,然后被失活进行下一轮反应。用各种TSA底物即可。

Q:多色时应基因/颜色应如何组合,考虑哪些因素?

A:做多色反应时,空间占位效应是首要考虑因素。因此可以先用较稳定的荧光底物标记低表达基因后再做高表达的。但如果表达位置不重叠,则可以后标记低表达的。建议一定先用单色分别确认各通道表达情况再在一张片子上做组合拍照。

Q:我可否更换自己的TSA底物?

A:可以。很多公司都有提供不同的TSA底物。但应详细测试底物浓度/反应时间对阴性背景与目标信号的影响。

Q:荧光强弱怎么调整?

A:调整底物浓度和反应时间。信号太强时,可以进一步稀释调整反应3浓缩液(500×)的稀释倍数,比如终浓度0.5×或0.25×。

Q:荧光拍照要注意什么?

A:所有片子相同通道应该使用相同的参数设置来拍照。切不可以过度曝光,过度曝光通常看到的只是背景信号。正常的荧光显微镜曝光时间不会超100ms。

Q:做好的玻片可以放多久?

A:用防淬灭的封片剂可以保存至少一个月。

Q:封片剂有什么要求?

A:必须用防淬灭封片剂(见手册建议)。

Q:数据怎么分析?

A:参考荧光免疫组化的分析方法,半定量分析或用软件分析。

Q:试剂是否要避光保存?

A:荧光底物必须避光保存。

关于RNA与蛋白质的共染

Q:可以做RNA和蛋白质的共染吗?

A:可以。

Q:是否提供蛋白质共染试剂?

A:不需要特别的共染试剂。蛋白部分按常规操作即可。

Q:RNA和蛋白质共染效果如何?有什么影响因素?

A:建议先在不同片子上分别做RNA与蛋白,确定信号分布模式后再做共染。因为做RNA检测时要用消化酶消化,因此对蛋白抗原一定有影响,有些抗原分子对消化酶不敏感,但有些很容易被消化酶破坏,因此要尝试不同的处理顺序或条件。而抗体稀释液试剂通常含RNase又需要长时间孵育,肯定造成RNA降解。因此不论哪个先做,另一个一定会受影响,先后顺序上应两者取其影响轻。

Q:共染时,要分别再做抗原修复吗?

A:做RNA时的煮沸步骤已经完成了抗原修复,因此如果先做RNA,通常染蛋白时不需要再做修复。

Q:有建议的操作步骤吗?

A:可以。 a)先按标准操作染完RNA后再染蛋白; b)也可先染蛋白结束后再染RNA;c)或者先做一抗,然后做RNA原位杂交,再做蛋白二抗。以上完全取决于哪种方案能取得最佳效果。通常是先RNA后蛋白。如果先做蛋白检测,则一定注意使用的抗体稀释液应保证不含有RNase,因为它会导致RNA降解。 如果蛋白染色的二抗是辣根过氧化物酶标记,由于RNA标记也是靠TSA反应,因此要注意应失活第一步骤中引入的辣根过氧化物酶后方可进行下一步TSA反应。详询技术支持。

Q:是否提供共染服务?

A:部分代理商可以提供。

关于检测服务

Q:公司目前提供哪些检测服务?

A:公司目前提供所有正常组织切片样本的RNA原位检测服务,但原则上不详细拍照,不分析实验结果。将片子寄回客户后由客户自行拍照分析。RNA与蛋白质的共染服务由部分代理商提供。

Q:检测服务送样有什么要求?

A:片子应符合实验手册建议的固定和切片标准。如果是第一次服务,其中一例样本应提供至少5张连续切片用于实验条件的优化。并填好样本信息表后打印连同样本用快递寄出。

Q:检测服务如何收费?

A:收费分为不包含试剂的服务费(需要购买探针和试剂,适合样本较多的客户),以及包含检测试剂的服务费(只需要单独购买探针,适合样本量少的客户)。按样本数计算费用,某些情况下(样本数少于3例)阴阳对照的费用也会计算。如遇特殊样本需要进行条件优化的,也按片数计算。

Q:检测服务是否提供照片和数据分析?

A:会做简单拍照以证明有/无检测信号,然后寄回客户自行扫描拍照分析,此举是为了避免荧光猝灭影响结果分析。