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实验结果问题指导 常见问题

没有信号或信号较弱

预处理条件不合适

解决方法：重新优化预处理煮沸时间和消化酶消化时间。

石蜡块和切片制备不正确

解决方法：检查样本固定使用的缓冲液组份和浓度，以及切片条件。

杂交过程组织切片部份或全部风干

解决方法： 检查杂交条件： ①每张切片滴上充足的杂交液 ②使用我们推荐的疏水笔，其它型号极易脱落 ③片子甩去洗液后，放在加热板上，马上滴加杂交液 ④检查杂交仪的水槽是否加水，盖子盖紧，保持杂交时的空间湿度。 ⑤孵育器保持水平放置勿倾斜。 ⑥用专用的温度计确认平板温度为40℃ ⑦操作过程不够迅速引至干燥。

杂交温度不对

解决方法：用专用温度计确认杂交温度40℃。

底物没有新鲜制备

解决方法：底物稀释液和底物必须新鲜制备，在10分钟内使用。

目标基因无表达

解决方法：测试目标基因的生物学阳性片。

目标RNA降解

解决方法：应尽量使用新鲜制备的石蜡样本，检查制备步骤合乎规范。实验时必须同时检测一张片子上的某个内参基因（比如PPIB）。 可适当增加反应4的杂交反应时间或者底物显色时间，但有可能导致背景升高。

信号弥散

杂交过程组织切片部份或全部风干

解决方法： 检查杂交条件： ①每张切片滴上充足的杂交液 ②使用我们推荐的疏水笔，其它型号极易脱落 ③片子甩去洗液后，放在加热板上，马上滴加杂交液 ④检查杂交仪的水槽是否加水，盖子盖紧，保持杂交时的空间湿度。 ⑤孵育器保持水平放置勿倾斜。 ⑥用专用的温度计确认平板温度为40℃ ⑦操作过程不够迅速引至干燥。

洗涤不够充分

解决方法：消化酶消化后至少用水洗两次。

底物没有新鲜配制

解决方法：底物应现配现用。

封片前玻片未干燥

解决方法：应彻底干燥后再封片。

组织形态问题

前处理方法有问题

解决方法：参照附录的条件优化前处理步骤每一步所需时间。

样品没有充分固定

解决方法：新鲜组织应使用10%NBF或4%PFA固定。

切片厚度有问题

石蜡切片必须为5±1μm。

组织脱片

烤片不足

解决方法：实验前应烤片30-60分钟。

前处理方法有问题

解决方法：参照附录的条件优化前处理步骤每一步所需时间，控制煮沸温度和消化酶处理时间，不能过久。

样本固定，包埋等步骤缓冲液有问题

解决方法：检查处理包埋步骤。

玻片问题

解决方法：选用我们推荐或验证过的带正电荷玻片。

高背景信号

杂交过程组织切片部份或全部风干

解决方法： 检查杂交条件： ①每张切片滴上充足的杂交液 ②使用我们推荐的疏水笔，其它型号极易脱落 ③片子甩去洗液后，放在加热板上，马上滴加杂交液 ④检查杂交仪的水槽是否加水，盖子盖紧，保持杂交时的空间湿度。 ⑤孵育器保持水平放置勿倾斜。 ⑥用专用的温度计确认平板温度为40℃ ⑦操作过程不够迅速引至干燥。

石蜡没有去除干净

解决方法：确认二甲苯和酒精充分浸泡洗涤。

洗涤不足

解决方法：每次杂交后应充分洗涤，不能只是浸泡。

玻片问题

解决方法：选用合适的玻片。

组织內源性过氧化物酶异常

解决方法：将预反应A时间延长至30分钟，或与技术支持联系。